于4°C，12,000rpm离心15s，小心将上清吸取弃之！加入约40µl2倍上样缓冲液，100°C变性5min，稍离心，取适量体积进行Westernblot实验，分别用商品化FLAG标签抗体和蛋白质Y抗体进行检测！通过免疫共沉淀确定结合蛋白1．用磷酸盐缓冲液洗30块10cm培养板上的适宜细胞！刮去每块板上的细胞到1ml冰冷的EBC裂解缓冲液中；2．将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4℃离心15；3．收集上清（约30ml）并加入30ug的适当抗体，4℃摇动免疫沉淀物1h；4．加入0！

　　要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀!确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定.以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法.其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来!如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来.

　　将收集的肽在ABI477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。注意事项：细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质——蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或TritonX-100）。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定！不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS），细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的!使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用.使用对照抗体：单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗兔多克隆抗体：正常兔IgG确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生！

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　　5ml/5x106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶）.用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）。4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中。准备ProteinAagarose，用PBS洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠。每1ml总蛋白中加入100ulProteinA琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景！

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　　取水稻叶片5g，经液氮研磨后，加入3倍体积蛋白IP缓冲液，在4°C混匀30min!于4°C，12,000g离心30min，将上清转移至一个预冷的新的离心管中！用0。22µm滤膜过滤上清，取过滤的50µl上清作为Input，用于蛋白质X的检测.Anti-FLAGM2AffinityGel预处理.取出50µl预混匀的Anti-FLAGM2AffinityGel转移至一预冷的离心管中!于4°C，4,000rpm离心1min，小心将上清吸取弃之.

　　9ml的蛋白质A-Sepharose悬液，4℃摇动免疫沉淀物30min；5．用含900mmol/LNaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重复洗5次！用NETN洗一次；6．吸出混合物的液体部分!加入800ul的1xSDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4min；7．将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中，在10mA的恒定电流下电泳过夜；8．通过考马斯亮蓝染色观察蛋白质泳带；9．从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1ml50%乙腈洗两次，每次3min；10．用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱；11．通过窄孔高效液相色谱分离肽。