加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔!在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）.加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀!温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟！配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用!洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干.

　　05MPH牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml！在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0!1ml，4℃过夜.次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）！加样：加一定稀释的待检样品0。1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时！然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）!加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。

　　加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外!温育：操作同洗涤：操作同5!显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟!10。终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）.1测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）.测定应在加终止液后15分钟以内进行。上海琛艺实业有限公司经过数年的努力发展已迅速成为集产品研发、生产、经营为一体的专业化生物工程公司。

　　37℃孵育0！5～1小时，洗涤.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0。1ml，37℃10～30分钟!终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0!05ml.牛血清白蛋白（BSA）0.1克加洗涤缓冲液至100ml或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10％使用！上海琛艺实业有限公司经过数年的努力发展已迅速成为集产品研发、生产、经营为一体的专业化生物工程公司!公司酶科品牌ELISA试剂盒研发的种属涵盖：人，大鼠，小鼠，猪，牛，羊，兔，植物，农残类，鱼类等.

　　由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种！即:用于检测抗体的间接法（图a）、用于检测抗原的双抗体夹心法（图b）以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等！比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:包被：用0！

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　　离心20分钟左右（2000-3000转/分）!仔细收集上清!保存过程中如有沉淀形成，应再次离心!组织标本：切割标本后，称取重量！加入一定量的PBS，PH4!用液氮迅速冷冻保存备用！标本融化后仍然保持2-8℃的温度!加入一定量的PBS（PH4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）！仔细收集上清.分装后一份待检测，其余冷冻备用!标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。

　　TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠叶酸(FA)呈正相关.用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠叶酸(FA)浓度！人成纤维细胞生长因子(FGF)ELISA试剂盒样本处理及要求：血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）.仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）!